質(zhì)粒菌株庫以PCR擴增為基礎(chǔ)的各類載體構(gòu)建，如大腸桿菌表達載體、酵母表達載體、桿狀病毒表達載體、哺乳動物表達載體；報告基因載體等。對于質(zhì)粒菌株庫中質(zhì)粒的提取可能會出現(xiàn)未提出質(zhì)粒或質(zhì)粒提取率較低的現(xiàn)象，如何分析解決呢？
1.大腸桿菌老化：涂布平板培養(yǎng)后，重新挑選新菌落進行液體培養(yǎng)。
2.質(zhì)粒拷貝數(shù)低：由于使用低拷貝數(shù)載體引起的質(zhì)粒DNA提取量低，可更換具有相同功能的高拷貝數(shù)載體。
3.菌體中無質(zhì)粒：有些質(zhì)粒本身不能在某些菌種中穩(wěn)定存在，經(jīng)多次轉(zhuǎn)接后有可能造成質(zhì)粒丟失。不要頻繁轉(zhuǎn)接，每次接種時應(yīng)接種單菌落。另外，檢查篩選用抗生素使用濃度是否正確。
4.堿裂解不充分：使用過多菌體培養(yǎng)液，會導(dǎo)致菌體裂解不充分，可減少菌體用量或增加溶液的用量。對低拷貝數(shù)質(zhì)粒，提取時可加大菌體用量并加倍使用溶液，可以有助于增加質(zhì)粒提取量和提高質(zhì)粒質(zhì)量。
5.溶液使用不當(dāng)：溶液在溫度較低時可能出現(xiàn)渾濁，應(yīng)置于37℃保溫片刻直至溶解為清亮的溶液，才能使用。
6.吸附柱過載：不同產(chǎn)品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的質(zhì)粒量很大，請分多次提取。
7.質(zhì)粒未全部溶解(尤其質(zhì)粒較大時)：洗脫溶解質(zhì)粒時，可適當(dāng)加溫或延長溶解時間。
8.乙醇殘留：漂洗液洗滌后應(yīng)離心盡量去除殘留液體，再加入洗脫緩沖液。
9.洗脫液加入位置不正確：洗脫液應(yīng)加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會*覆蓋硅膠膜的表面達到最大洗脫效率。
10.洗脫液不合適：DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫。洗脫效率還取決于pH值，最大洗脫效率在pH7.0-8.5間。當(dāng)用水洗脫時確保其pH值在此范圍內(nèi)，如果pH過低可能導(dǎo)致洗脫量低。洗脫時將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加熱至60℃后使用，有利于提高洗脫效率。
11.洗脫體積太小：洗脫體積對回收率有一定影響。隨著洗脫體積的增大回收率增高，但產(chǎn)品濃度降低。為了得到較高的回收率可以增大洗脫體積。
12.洗脫時間過短：洗脫時間對回收率也會有一定影響。洗脫時放置1min可達到較好的效果。
更新時間：2021-07-21 
瀏覽次數(shù)：676
我的位置：
